Која је разлика између ПЦР и серолошког теста?

Г.С.
Која је разлика између ПЦР и серолошког теста?

У контексту пандемије вируса корона спомињу се двије врсте тестова – ПЦР и серолошки. Међутим, ови тестови нису замјенљиви, базирају се на потпуно другачијим биолошким принципима и дају другачије информације.

 

За шта се користе једни, а за шта други тестови, како функционишу те колико су прецизни?

ПЦР тестови

ПЦР (пи-си-ар, према правилима спеловања у енглеском језику) је акроним за Полyмерасе Цхаин Реацтион, односно ланчану реакцију полимеразе, процедуру коју је 1983. развио нобеловац Кери Мулис. Овом методом научници повећавају број – врше амплификацију – одређених сегмената нуклеинских киселина, односно насљедног материјала. Оригинално, ПЦР је био метода амплификације сегмената ДНК, а касније је развијена и верзија која амплифицира РНК. Сврха ПЦР јесте да се створи довољно генетичке секвенце која би се могла детектовати и анализирати.

Наиме, оба ове молекула – и ДНК и РНК – представљају насљедни материјал, с одређеним разликама у структури. Обично се ДНК састоји од два ланца који имају различите смјерове и увијени су у спиралу, а РНК има 1 ланац, мада постоје и изузеци, другачије молекуле. Заједничка "слова" ДНК и РНК су А (компонента аденин, нуклеинска база по саставу), Г (нуклеинска база гванин) и Ц (нуклеинска база цитозин). Разликују се по томе што у ДНК имамо слово Т (нуклеинска база тимин), а код РНК У (урацил). Редослијед ових "слова" одређује редослијед аминокиселина у ланцу протеина, али и копирање генетичке шифре.

Проблем је што вируси, за разлику од живих бића, могу имати само или ДНК или РНК као инструкцију за своју репликацију. Ми у нашим ћелијама имамо и ДНК и РНК, као што их имају и ћелије осталих живих бића – бактерија, гљива, биљака, али вируси имају само или ДНК или РНК. САРС-ЦоВ-2 има само РНК.

Не улазећи у детаље изолације насљедног материјала и циклуса ПЦР те других принципа на којима се заснива ова техника, треба скренути пажњу да је откривање РНК вируса засновано на мало модификованој ПЦР технологији коју називамо РТ-ПЦР, а што је скраћеница од Реверсе трансцриптион полyмерасе цхаин реацтион тј. ланчана реакција полимеразе помоћу реверзне транскриптазе, једног ензима који РНК вируси користе када претварају наше ћелије у "фабрике" за производњу својих копија. Ову РТ-ПЦР треба разликовати од Реал-тиме ПЦР, технике која такође има скраћеницу РТ-ПЦР, а представља ПЦР у стварном времену, пише "Воице оф Америца".

Сви ови термини, ако нисте биолошке, хемијске или медицинске струке, могу звучати страшно и тешко су схватљиви лаицима. Међутим, лакше је разумјети када имате информацију да се вирусна РНК, да би се вирус копирао у инфицираним станицама, на примјер човјека, мора преписати, "учитати" на ДНК човјека, што је процес супротан ономе што се обично дешава – ДНК се преписује на РНК да би се произвело нешто што је кодирано неким дијелом ДНК (тај дио који кодира зовемо ген). То нешто што се произведе је протеин, а различити протеини имају различите улоге у организму – неки граде ћелије, ткива и просторе између ћелија, неки служе да убрзавају биохемијске реакције у организму, неки "преносе поруке".

РТ-ПЦР технологија опонаша оно што ради вирус када инфицира станицу – РНК се "уписује" у ДНК реверзно. Ми једноставно претварамо РНК у ДНК, и то не било коју него у такозвану комплементарну ДНК (енг. цДНА), која је на неки начин "одраз" почетне РНК молекуле, само писан супротним словима генетичке абецеде. У генетичкој "абецеди", стварају се парови база: аденин и тимин, гванин и цитозин тј. цитозин је "супротан" гванину, а аденин је "супротан" тимину. На мјестима гдје је на РНК вируса био цитозин, на комплементарној ДНК ће бити гванин.

Затим се та комплементарна ДНК "догради" да се створи други дио ланца ДНК молекуле, који је заправо слика и прилика оне наше почетне РНК молекуле. Онда амплифицирамо ту ДНК помоћу ПЦР технике и знамо шта се налази у узорку. Једино што умјесто урацила, слова "У", овај молекул има тимин, слово "Т", али то не мијења значење поруке и научници ће знати да је та секвенца иста. Најважније – ово је метода која нам омогућава да детектујемо постојање РНК у узорку, а управо ово нам треба како бисмо доказали постојање вируса.

Када имамо специфичну РНК – генетички код вируса познат, онда можемо да га користимо као референцу и упоредимо шта смо добили методом ПЦР с већ познатом секвенцом. Индиректно, доказујући постојање РНК специфичног вируса, доказујемо и његово постојања. Кинески научници су у јануару ове године дешифровали РНК вируса и ове податке оставили доступним другим научницима.

Како се узима узорак за ПЦР тест?

Узорак се може узети на различите начине, рецимо назофарингеалним брисом у којем се узорак узима на задњој страни носа и грла, што значи помало непријатно гурање алата за узимање бриса у носницу и то прилично дубоко. Алат за узимање бриса је мало дужи штапић са врхом прекривеним ватом – као дужа верзија штапића за чишћење ушију.

Узимање узорка се може радити узорковањем испљувка, спутума. Америчка ФДА је средином априла одобрила и узимање узорка пљувачке за детекцију САРС-ЦоВ-2. Треба знати да и од мјеста и начина узимања бриса зависи његова прецизност. Неки тестови из "Yале Университy Сцхоол оф Публиц Хеалтх" показују да је чак узорак пљувачке сензитивнији и можда бољи показатељ, али потребно је још доказа да се ово покаже као тачно те да се овај метод настави користити или истисне назофарингеални брис. Узимање назофарингеалног бриса данас је преовлађујућу метод за овај тест, пише "Воице оф Америца".

ПЦР тест се користи иза детекцију вируса на површинама и у аеросолу, а не само у живим организмима.

За добијање резултата ПЦР теста, што укључује изолацију вируса тј. изолацију и екстракцију вирусне РНК, те циклус ПЦР машине, потребно је неколико сати (5-6), а резултате тестирана особа добија обично унутар 24х. Циклуси ПЦР подразумијевају циклусе хлађења и загријавања добијеног ДНК молекула у којима се он раздваја на два ланца при загријавању и поново спаја с додатним градивним компонентама при хлађењу, стварајући тако све више и више молекула.

Које су мане ПЦР теста?

Овај тест показује да ли је нека особа тренутно заражена, али само под одређеним претпоставкама: да је узорак узет у најпогоднији час, односно да није узет прерано. Уколико се узорак узме прерано, а особа је инфицирана, тест ће бити лажно негативан. Потребно је времена да се у нашим ћелијама репликује довољно вируса како би га ова техника могла детектовати, односно, иако је техника врло осјетљива, постоји један праг осјетљивости испод које не детектује вирусни генетички материјал.

Стога је потребно практично сваки дан тестирати особе у самоизолацији које имају епидемиолошку индикацију - да су биле у контакту са зараженом особом или ако долазе из неког погођеног подручја. Тек око два дана прије појаве првих симптома, ПЦР тест може дати позитиван резултат, односно, има довољно вирусног материјала за детекцију. Тада особа постаје и инфективна за друге. До тада, тест може дати лажно негативан резултат.

Са друге стране, ПЦР тест не разликује живог од мртвог узрочника – ово је тест који само проналази специфичне генетичке секвенце вируса. Рецимо, пронађена вирусна РНК на некој површини не значи аутоматски да је та површина заразна тј. да је вирус инфективан.

Исто тако, ПЦР ће показати присутност вирусне генетичке секвенце и код особе која је пребољела Ковид-19, али то неће значити да је особа поново обољела, него једноставно да се у њеном организму још налазе остаци вируса који чак и не морају бити инфективни. Али, све док се не покаже негативан тест, држимо да је та особа инфективна. Овдје би се радило о лажно позитивном тесту.

Стога је код интерпретације ПЦР теста потребно бити опрезан, а постоји читав низ фактора који могу довести до лажно позитивног или лажно негативног теста, пише "Воице оф Америца".

Ово иде у прилог томе да ове тестове могу радити само обучене особе те да узорке могу узимати само обучене особе и да само стручњаци могу интерпретирати тест те је неспроводиво да овакве тестове раде особе које немају биолошко-медицинско знање.

Серолошки тестови: тестови антитијела

Овдје се ради о тестовима за који се узима крв и у крви траже специфична антитијела која је организам произвео као имунолошки одговор на инфекцију вирусом САРС-ЦоВ-2 релативно су нешто бржи од ПЦР теста.

По хемијском саставу, антитијела су протеини, које зовемо групним именом имуноглобулини (Иг). Има их неколико типова: ИгА, ИгД, ИгЕ, ИгГ и ИгМ. Ово су протеини чија структура, 3Д модел, понешто подсјећа на слово "Y", а сам молекул се састоји из дијела који је сталан и промјенљивих региона, кључних за везивање онога што зовемо антиген – твар, патоген, изазивач болести или неки његов дио на који организам реагује имунолошким одговором.

Од тренутка када организам реагује на заразу, стварају се антитијела. Нека антитијела остају у организму још дуго времена и управо би она требало да нам пруже имунитет на болест коју смо прележали. Овдје су посебно значајни имуноглобулини – антитијела ИгГ, ИгА и ИгМ. ИгМ се јављају у току болести и остају и у периоду када се болесник опоравља, док се ИгГ јављају у почетку периода када се болесник опоравља и након опоравка.

Детекцијом ИгГ антитијела детектује се заправо да ли је неко преболио инфекцију и има ли имунитет на специфичну болест. Детекција ИгМ антитијела значи и детекцију активног обољења, али већ у фази када се покажу симптоми или у фази опоравка – не прије, за разлику од ПЦР теста који може показати да је особа инфицирана и неколико дана прије појаве симптома, под предусловом да има довољно репликованог вируса у циљаним ћелијама (у случају Ковид-19, ради се о ћелијама респираторног система, које облажу респираторне путеве).

Негативни резултат серолошког не искључује да није дошло до инфекције јер мали број – сасвим мали проценат - људи не развије антитијела и њих зовемо "нереактанти". Али већина људи ипак развије ове протеине, само не знамо како све то функционише у случају Ковид-19, пише "Воице оф Америца".

За сада још не знамо да ли детектована антитијела на Ковид-19 значи и да ли је особа имуна, тј. да ли се не може више заразити. Такође, ако се формира имунитет, не знамо колико дуго траје.

Шта даље слиједи?

У будућности бисмо могли очекивати и тестове који детектују антиген вируса – неки протеин вирусне капсиде довољно специфичан да бисмо, ако га детектујемо у крви, знали да је ријеч о САРС-ЦоВ-2. Антигенски тестови на овај вирус још не постоје, јер научници траже који би протеин био адекватан маркер за ову сврху. Америчка ФДА је 9. маја ауторизовала први антигенски тест за брзу детекцију САРС-ЦоВ-2.

Тестирања су важна јер не само да откривају заражене особе, него показују и да ли је нека особа пребољела инфекцију и може ли се вратити на радно мјесто или, ако је у карантину, није инфицирана ни након очекиваног периода инкубације те може изаћи из карантина. Такође, посебно у периоду који долази, тестови популација ће бити изузетно важни да се прецизније утврди број обољелих и процијени проценат популације који је оболио, био "прокужен" вирусом те потенцијално можда стекао имунитет.

Ово ће се радити серолошким тестовима, а та врста тестирање ће показати и удио асимптоматских преносилаца, особа које су имале врло благе симптоме или нису ни осјетиле да су инфициране наспрам идентификованих случајева.

Процјена тога ће дати и процјену колико је популације прокужено новим вирусом, али и промијенити удио смртних и тешких случајева на укупан број случајева. Међутим, треба имати на уму да, чак и када ове процјене, како очекујемо, смање морталитет тј. леталитет од Ковид-19, ова болест је и даље једна од топ инфекција и нови бројеви неће умањити озбиљност тога што се догодило.

 

© АД "Глас Српске" Бања Лука, 2018., ISSN 2303-7385, Сва права придржана